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Produktdetails:
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| Produkt-Name: | qPCR | Lagertemperatur: | – °C 20 |
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| Robust und aktiv für cDNA Synthese: | bis zu 55°C. | Anwendung: | PCR |
| Volumen: | 1ml | Rückübertragung: | Temperaturspanne (42-60°C) |
| Markieren: | Universal-QPCR-Vorlagenmischung,Vorlagenmischung des Schablonen-Verdünnungs-Puffer-QPCR,QPCR-Hauptmischungs-biochemisches Reagens |
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qPCR Grün 2×Universal blaues GSK Vorlagenmischung mit Verdünnungs-Puffer der Schablonen-40×Yellow
Einleitung von qPCR Grün 2×Universal blaues GSK Vorlagenmischung:
Dieses Produkt ist eine Lösung des Mischguts 2x für qPCR unter Verwendung der chimeric Fluoreszenzmethode GSK-Grüns I. Die Kernkomponente, Taq DNA-Polymerase, ist eine Hitze-aktivierte DNA-Polymerase, die durch Antikörpermethode blockiert wird, die unspezifische Verstärkung unter niedrigen Temperaturbedingungen effektiv hemmen kann. Unterdessen kombiniert mit dem Reaktion Puffer optimierte für qPCR, ist Taq DNA-Polymerase für hohe Besonderheit und Empfindlichkeit qPCR Reaktion sehr passend. Eine gute Standardkurve kann in einem breiten quantitativen Bereich erreicht werden, der genau zuverlässig ist, reproduzierbar und für die quantitative Analyse von Zielgenen. Gleichzeitig enthält dieses Produkt eine spezielle passive Färbung ROX Bezugs, die für Gebrauch in allen qPCR Instrumenten passend ist-, und es gibt keinen Bedarf, die ROX-Konzentration auf verschiedenen Instrumenten zu justieren. Blaue Färbung wird im Mischgut hinzugefügt, das den Indikatoreffekt des Addierens von Proben hat, und gelbes Schablonenverdünnungsmittel wird gleichzeitig zur Verfügung gestellt. Wenn die Schablone mit gelbem Schablonenverdünnungsmittel verdünnt wird und in das blaue Reaktionsmischgut, die Farbänderungen von Blau zu Grün hinzufügte, das eine Indikatorrolle in der Vorbereitung des Reaktionssystemprozesses spielen und Durchsickern oder misaddition verhindern kann. Die Spektren der blauen und gelben Färbungen überschneiden nicht mit den qPCR Färbungen und beeinflussen nicht die Reaktionsergebnisse.
Produktinformation von qPCR Grün 2×Universal blaues GSK Vorlagenmischung:
| Produktname | Identifizierung des Produktes | Modell |
| blaue grüne qPCR 2×Universal Vorlagenmischung mit Verdünnungs-Puffer der Schablonen-40×Yellow | GS-MBP0044-01 | 1ml |
| GS-MBP0044-05 | 5×1 ml | |
| GS-MBP0044-15 | 15×1 ml |
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Speicher-und Behandlungs-Bedingungen mit blauer grüner qPCR 2×Universal Vorlagenmischung mit Verdünnungs-Puffer der Schablonen-40×Yellow:
Nasser Eisbeuteltransport; Gespeichert bei -20℃ Temperatur, gültig für 12 Monate.
Proben-Protokoll/Verfahren:
1. (Optionale) Schablonenverdünnung von qPCR Grün 2×Universal blaues GSK Vorlagenmischung:
Diese Ausrüstung liefert einen GELBEN Verdünnungs-Puffer der Schablonen-40x, eine 40 Falte verdünnte gelbe Schablonen-Verdünnung, die verwendet werden kann, um genau zu bestimmen, ob die Schablone der qPCR Reaktionsflüssigkeit hinzugefügt worden ist, indem man die Farbe der Flüssigkeit änderte. Das qPCR 20ul Reaktionssystem, entsprechend der Verdünnungsschablonenmenge als Beispiel nehmen fügte in die qPCR 20ul Reaktionslösung, die entsprechende Verdünnungsmethode der ursprünglichen Schablone kann beziehen auf der folgenden Tabelle hinzu (die ursprüngliche Schablone als Beispiel verdünnt zu 100ul nehmend):
| Fügen Sie die verdünnte Schablone der qPCR 20ul Reaktionslösung hinzu (UL) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Fügen Sie den GELB 40x Schablonen-Verdünnungs-Puffer dem Verdünnungs-System der Schablonen-100ul hinzu (UL) | 50 | 25 | 16,7 | 12,5 | 10 | 8,4 | 7,2 | 6,3 |
| Fügen Sie das Verdünnungs-System der Schablonen-100ul der Primärschablone hinzu (UL) | x | x | x | x | x | x | x | x |
| Volumen des Addierens der Nuklease - freies Wasser (UL) | 50-x | 75-x | 83.3-x | 87.5-x | 90-x | 91.6-x | 92.8-x | 93.7-x |
Beispiel:
2ul verdünnte Schablone sollte qPCR 20ul Reaktionssystem hinzugefügt werden.
Das Verdünnungssystem der Schablonen-als Beispiel nehmend 100ul, wenn das ursprüngliche Schablonenvolumen 20ul ist, Schablonen-Verdünnungs-Puffer 25ul 40x wird gelber addiert, und dann wird Nuklease-freies Wasser 55ul dem Gesamtvolumen von 100ul hinzugefügt.
Der GELBE VERDÜNNUNGS-PUFFER DER SCHABLONEN-40x ist jetzt 10x. Fügen Sie 2ul der verdünnten Schablone in einen Verdünnungs-Puffer der Verdünnungs-20ul hinzu, und der abschließende GELB 40× Schablonen-Verdünnungs-Puffer ist 1x. Als schlußfolgerung sollte der gelbe Schablonen-Verdünnungs-Puffer 1x im abschließenden qPCR System sein.
Anmerkung: Wenn die Schablone nicht braucht verdünnt zu werden oder wenn das Schablonenverdünnungsmittel von G3362-2 nicht benutzt wird, können Sie diesen Schritt ignorieren.
2. Empfehlen Sie das qPCR Reaktionssystem über qPCR Grün 2×Universal blaues GSK Vorlagenmischung::
| Komponente | rxn 20ul | rxn 50ul | Abschließendes Concentraction |
| qPCR Grün 2×Universal blaues SYBR Vorlagenmischung | 10ul | 25ul | 1× |
| Vorwärtszündkapsel (10uM) a | 0.4ul | 1ul | 0.2uM |
| Rückzündkapsel (10uM) a | 0.4ul | 1ul | 0.2uM |
| Templateb | Variable | Variable | wie erforderlich |
| Nuklease-freies Wasser | Fügen Sie 20ul hinzu | Fügen Sie 50ul hinzu |
a. Normalerweise kann ein guter Verstärkungseffekt mit der abschließenden Konzentration von 0.2um erhalten werden. Wenn die Reaktionsleistung arm ist, kann die Zündkapselkonzentration im Bereich von 0.2-1.0um justiert werden.
b. Die Menge des Schablonenzusatzes schwankt mit der Kopienzahl des Zielgens in der Schablonenlösung, und die passende Menge des Schablonenzusatzes wird durch Steigungsverdünnung besprochen. Die beste Zusatzmenge von Schablone DNA im System der Reaktion 20ul war kleiner als 100 ng. Als das cDNA (Funktelegrafie-Reaktionslösung) von RT-PCR Reaktion als Schablone benutzt wurde, sollte die Zusatzmenge 10% des Gesamtvolumens der PCR-Reaktionslösung nicht übersteigen.
3. Pcr-Reaktionsverfahren (kann entsprechend den Instrumenten justiert werden):
a: Wenn Verstärkungsbesonderheit verbessert werden muss, kann Temperatur des zweistufigen Verfahrens oder der Vergütung verwendet werden; Um die Verstärkungs-Leistungsfähigkeit zu verbessern, können ein dreistufiges Verfahren oder eine Erweiterungszeit verwendet werden.
Anmerkung:
1. Tragen Sie bitte Wegwerfhandschuhe während der Operation, um RNaseverschmutzung zu vermeiden.
2. Die Rückübertragungsprodukte können an -20℃ für kurze Zeit gespeichert werden. Wenn Langzeitlagerung erforderlich ist, wird es empfohlen, um sie an -80℃ zu speichern, nachdem man, zum von wiederholten Frieren-Tauenzyklen zu vermeiden verpackt hat.
3. Wenn die Schablone vom eukaryotic Ursprung ist, wird es empfohlen, um Oligo (Papierlösekorotron) Zündkapsel 18 vorzuwählen und sie mit dem 3' Poly ein Endstück von eukaryotic mRNA zusammenpaßt, zum des höchsten Ertrags von cDNA zu erreichen in voller Länge.
4. Für Rückübertragung von prokaryotic RNS, sollten gelegentliche Hexamer Zündkapsel oder Gene Specific Primer verwendet werden.
5. Gelegentliche Hexamer-Zündkapsel hat breite Anwendbarkeit und ist für mRNA, rRNA, tRNA, kleine RNS und lncRNA Schablonen passend.
6. Wenn Rückübertragung von qPCR Probe gefolgt wird, können Oligo (Papierlösekorotron) Zündkapsel 18 und gelegentliche Hexamer-Zündkapsel gemischt werden, um cDNA Synthese-Leistungsfähigkeit in allen Regionen von mRNA das selbe zu machen, das hilft, die Echtheit und die Wiederholbarkeit von quantitativen Ergebnissen zu verbessern.
7. Wenn die folgenden qPCR Zündkapseln über Exons entworfen sind, kann der Genomabbauschritt ausgelassen werden.
Zündkapselgestaltungsprinzipien:
1. Die Länge des Verstärkungsproduktes wird empfohlen, um zwischen 80-300 BP zu sein;
2. Zündkapsellänge: 18-25 BP;
3. Der Inhalt der Basis G+C in den Zündkapseln sollte zwischen 40%-60% sein;
4. Der TM-Wertunterschied zwischen Vorwärtszündkapseln und Rückzündkapseln ist kleiner als 2℃, und der TM-Wert zwischen 58-62℃ ist das beste;
5. Zufallscharakter der niedrigen Verteilung;
6. Zündkapseln sollten selbst-ergänzende Reihenfolgen nicht enthalten, andernfalls bilden sie eine Sekundärhaarnadelstruktur;
7. Es sollte geben nicht mehr als 4 ergänzend oder übereinstimmende Basis zwischen zwei Zündkapseln, andernfalls wird Zündkapseldimer, besonders ergänzende Deckung am 3' Ende gebildet;
8. Das 3' Terminalbasis der Zündkapsel wird vorgeschlagen, um G oder C zu sein;
9. Keine anderen unspezifischen Produkte wurden in den NCBI-Vergleichsergebnissen gefunden.
Allgemeine Probleme und Lösungen:
| Problembeschreibung | Mögliche Gründe | Lösungen |
| Am Ende der Reaktion, erschien keine Verstärkungskurve, oder CT-Wert erschien zu spät | Die Schablonenkonzentration ist zu niedrig | Wiederholen Sie das Experiment, um die Schablonenverdünnungsmehrfachverbindungsstelle zu verringern und Anfang von der höchsten Konzentration, wenn die Beispielkonzentration unbekannt ist- |
| Schablonenverminderung | Die Schablone wurde wieder vorbereitet und das Experiment wurde wiederholt | |
| Es gibt PCR-Hemmnisse im System | Im Allgemeinen wird die Schablone herein getragen, wird das Verdünnungsverhältnis der Schablone erhöht, oder die Schablone mit hohem Reinheitsgrad wird reprepared und wiederholt | |
| Zündkapseln vermindern möglicherweise | Zündkapseln, die nicht für eine lange Zeit benutzt worden sind, sollten auf Integrität durch SEITEN-Elektrophorese zuerst geprüft werden, um die Möglichkeit der Verminderung durchzustreichen | |
| Niedrige Verstärkungs-Leistungsfähigkeit | ncrease die Zündkapselkonzentration, versuchen ein dreistufiges Verstärkungsverfahren oder entwerfen die Zündkapsel neu | |
| Das Verstärkungsprodukt ist zu lang | Die Verstärkungsproduktlänge wurde im Bereich von 80-300 BP gesteuert | |
| Die Leerzeichenaufbereitungssteuerung zeigt das Signal | Reaktionssystemverschmutzung | Erstens sollte das Leerzeichenaufbereitungssteuerungswasser ersetzt werden. Wenn die gleiche Situation noch auftritt, sollten die Zündkapseln, die Saugapparate und DIE PCR-Rohre ersetzt werden, oder eine neue Vorlagenmischung sollte begonnen werden. Das Reaktionssystem wird in eine super saubere Tabelle vorbereitet, um Aerosolverschmutzung zu verringern |
| Unspezifische Verstärkung wie Zündkapseldimer erscheint |
Im Allgemeinen ist es normal für die Verstärkungsprodukte, in der Leerzeichenaufbereitungssteuerung nach 35 Zyklen zu erscheinen, die mit der schmelzenden Kurve analysiert werden sollten. Neukonstruktionszündkapsel, justieren Zündkapselkonzentration oder PCR-Reaktionsverfahren zu optimieren |
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| Die schmelzende Kurve hat mehrfache Spitzen | Zündkapselentwurf ist schlecht | Die neue Zündkapsel wurde entsprechend den Zündkapselgestaltungsprinzipien neu entworfen |
| Zündkapselkonzentration ist zu hoch | Verringern Sie Zündkapselkonzentration passend | |
| Es gibt genomische Verschmutzung in cDNA Schablone | Die extrahierte RNS-Lösung wird unter Verwendung DNA-Enzyme, wie DSDNase, um genomische Verschmutzung zu entfernen, verdaut oder transintron Zündkapseln zu entwerfen | |
| Schlechte Reproduzierbarkeit von Experimenten | Der Fehler des Addierens der Probe ist groß |
Der Gebrauch der genauen Pipette, mit genauer Pipette der Ansaughöhe der hohen Qualität; Hohe Verdünnungsschablone, umfangreiche Schablone addierend, um Stichprobenfehler zu verringern; Das Reaktionsvolumen von qPCR wurde vergrößert |
| Die Schablonenkonzentration ist zu niedrig | Wiederholen Sie das Experiment, um die Verdünnungszeiten der Schablone zu verringern | |
| Temperaturabweichung an den verschiedenen Standorten des qPCR Instrumentes | Kalibrieren Sie das qPCR Instrument regelmäßig | |
| Die Verstärkungskurve ist nicht glatt | Fluoreszenzsignal ist zu schwach, produziert nach Systemkorrektur |
Garantieren Sie, dass die Färbungen, die in der Vorlagenmischung vorgemischt werden, nicht vermindert werden; Ersetzen Sie Leuchtstoffsignal, qPCR Verbrauchsmaterialien besser zu sammeln |
| Verstärkungskurvenbrüche oder -belege | Die Schablonenkonzentration war höher und der Grundlinienendpunktwert war größer als der CT-Wert | Der Grundlinienendpunkt (Ct-Wert -3) wurde und die Daten wurden neu analysiert verringert |
| Verstärkungskurven von einzelnem Wells fielen plötzlich scharf | Es gibt Blasen im Reaktionsrohr |
Garantieren Sie, dass MISCHUNG vollständig aufgelöst wird, und wirbeln Sie nicht und oszillieren Sie gleichmäßig; Nachdem die Probe addiert ist, werden die Blasen durch Zentrifugierung mit hellem Gummiband entfernt. Die Vordenaturierungszeit wurde auf Minute 10, die Blasen zu entfernen verlängert |
Wenn Sie mehr Informationen über die qPCR Grün 2×Universal blaues GSK Vorlagenmischung mit Verdünnungs-Puffer der Schablonen-40×Yellow benötigen, informieren Sie uns bitte online, danke.
Ansprechpartner: Ms. Kris Zhang
Telefon: 0086-0769-85914911
